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L’ingegneria genetica e la biologia molecolare

Scienza&Tecnologia

L’ingegneria genetica sempre più alla portata di tutti sta rivoluzionando la biologia molecolare

Negli ultimi anni è balzata agli onori della cronaca una nuova metodologia di modificazione genetica che potrebbe avere ripercussioni mirabili in differenti campi di applicazione: medicina, biologia e tecnologia.
Tutto iniziò nel 1993 ad opera di un giovane biologo, Francisco Mojica, che stava studiando una specie di archeobatteri alofili, cioè con un’estrema tollerabilità a elevate concentrazioni saline. Analizzando alcuni frammenti del DNA di questo organismo, Mojica aveva scoperto la presenza in essi di copie multiple e quasi identiche di una sequenza palindroma di circa 30 basi. Il palindromo (dal greco antico πάλιν “di nuovo” e δρóμος “percorso”, col significato “che può essere percorso in entrambi i sensi”) è una sequenza di caratteri che, letta al contrario, rimane invariata. In ambito biologico, la sequenza palindroma assume significati solitamente rilevanti nella regolazione dell’espressione dei geni e, quindi, nella produzione di proteine.

Queste strane sequenze ripetute, infatti, erano separate da tratti di DNA altrettanto caratteristici, sempre lunghi 36 basi. La cosa curiosa è che tratti di DNA con caratteristiche simili erano presenti anche in altre specie di batteri filogeneticamente molto distanti, da cui si dedusse che dovevano avere una funzione importante, dato che si erano conservati nel corso delll’evoluzione.
Vennero chiamate CRISPR (si pronuncia crisper), da Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (brevi ripetizioni palindrome interspaziate in modo regolare).
Circa dieci anni più tardi, nel 2002, la presenza di CRISPR venne rilevata in circa 40 specie di batteri ma, quanto al loro ruolo, non c’era ancora alcuna certezza. Fu solo quando Mojica si concentrò sui tratti di DNA spaziatore (spacer), che arrivò l’intuizione giusta.

Uno spaziatore presente nel batterio Escherichia coli, infatti, presentava la stessa sequenza di basi di un virus, il batteriofago P1, che infetta proprio questi batteri. Eppure, il particolare ceppo di E. coli analizzato da Mojica risultava immune all’infezione: Mojica iniziò a sospettare che ci potesse essere una correlazione tra la resistenza all’infezione e la presenza del DNA virale nei batteri.
Batteri e affini, in generale definiti procarioti, hanno comunque evoluto, plasmandoli nel corso di milioni di anni di evoluzione, finissimi meccanismi di difesa nei confronti dei loro patogeni, nella fattispecie i virus batteriofagi: pacchetti di materiale genetico avvolto e protetto da proteine che infettano le cellule batteriche, sfruttandone il meccanismo di produzione proteica per la propria replicazione (motivo per cui i virus non possono essere definiti propriamente organismi viventi, mancando in essi la capacità di replicare se stessi autonomamente).

Le CRISPR presto dimostrarono di contenere le istruzioni per innescare un meccanismo in grado di proteggere i batteri dalle infezioni virali.

Altri ricercatori in Francia, intanto, stavano giungendo alle stesse conclusioni e un’ulteriore conferma arriverà nel 2007 dal laboratorio di un’azienda danese di prodotti caseari. Qui tecnici e ricercatori stavano cercando di selezionare ceppi di Streptococcus thermophilus, un batterio comunemente utilizzato per la produzione di yogurt e formaggi, resistenti alle infezioni virali. Si scoprì che i batteri che presentavano sequenze spaziatrici simili a tratti di DNA presenti in alcuni virus, risultavano immuni all’infezione da parte di questi ultimi. Il DNA spaziatore, infatti, è proprio costituito da tratti di DNA virale, originati da virus che hanno infettato i batteri in precedenza. In pratica, a ogni invasione virale, frammenti di DNA del nemico sono integrati nei CRISPR, come nuovi spaziatori, costituendo una specie di sistema immunitario che, in qualche modo, protegge i batteri da successive invasioni.

Il meccanismo di protezione è alquanto complesso e cercheremo di semplificarlo al massimo. Queste sequenze vengono trascritte in particolari molecole di RNA che funzionano come sentinelle, in grado di riconoscere tratti complementari di DNA virale. Se lo stesso tipo di virus al quale era stato “strappato” lo spaziatore torna a infettare il batterio o la sua progenie, le molecole di RNA sentinella (o RNA guida), trascritte a partire da quello spaziatore, lo riconoscono grazie al meccanismo di complementarietà tra basi. A questo punto, però, bisogna chiamare in causa anche un nuovo elemento, un enzima. Si tratta di una nucleasi, cioè un enzima in grado di tagliare le molecole di DNA e di RNA, chiamata Cas9. Cas è acronimo per CRISPR-associated protein (proteina associata a CRISPR).
L’enzima Cas9 è associato alle molecole di RNA-guida: una volta che queste hanno legato il DNA virale, Cas9 si attiva e frammenta quest’ultimo, inattivandolo.

Ci sono voluti anni per comprendere appieno le struttura e il meccanismo di funzionamento del complesso CRISP-Cas 9 nei batteri: una volta chiarita l’organizzazione ed il flusso di lavoro se ne compresero le potenzialità e la sua introduzione nell’ingegneria genetica fu conseguenza logica.
Il complesso, ingegnerizzato dai ricercatori e opportunamente semplificato, viene utilizzato per silenziare geni difettosi o addirittura ripararli attraverso processi semplici, quasi alla portata di tutti.
Non da meno, la semplicità di utilizzo e la poliedricità delle applicazioni ha fatto nascere in rete intorno ai CRISPR un sottobosco di forum, blog e siti di e-shop dove ci si scambia pareri, consigli e si acquistano i kit per modificare il genoma di una vasta gamma di organismi viventi.

L’ utilizzo di queste strategie è particolarmente ben visto in ambito di genetica vegetale per l’ottenimento di ogm con un controllo più preciso del punto di inserimento del materiale genetico introdotto.
Esistono infatti differenti processi attraverso i quali inserire DNA estraneo in una cellula vegetale che si differenziano per l’efficacia della trasformazione e la facilità di utilizzo.
Fino a qualche anno fa la tecnica d’elezione si basava sull’utilizzo di un batterio opportunamente modificato, l’Agrobacterium tumefaciens e sfruttava la naturale propensione del microrganismo ad infettare le cellule vegetali introducendo in esse tratti del proprio patrimonio genetico che permette alle cellule infettate di produrre enzimi ed ormoni vegetali che favoriscono la proliferazione batterica: batteri, quindi, opportunamente modificati e resi innocui in laboratorio venivano utilizzati per veicolare la produzione di molecole d’interesse direttamente dalle piante.

Una delle principali obiezioni all’utilizzo di questa tecnica di produzione di OGM verteva sul fatto che il patrimonio genetico estraneo alla pianta si inseriva, anche in molteplici copie, in differenti punti del genoma delle cellule vegetali, introducendo mutazioni per inserzione di cui si ignoravano gli effetti.
Questi dubbi vengono fugati in parte mediante l’utilizzo della tecnologia CRISPR per la modificazione del DNA: attraverso le sequenze RNA guida, infatti, si ha la possibilità di tagliare il genoma solo in punti prefissati, presenti solo nei geni che si ha interesse a modificare.
Data quindi la maggior affidabilità dell’intervento di modifica genetica basato sul CRISPR, le sue applicazioni sono varie: è usato per studiare, per esempio, la funzione di alcuni geni, eliminandoli dal genoma di una forma di vita e restando poi a vedere che cosa succede. Oppure per capire quali siano le parentele di gruppi di animali modificando il loro patrimonio genetico. Ma è servita anche, a livello pratico, per modificare lieviti in modo che producessero biocarburante, o per produrre organismi di interesse agricolo cambiando i geni con altri, considerati più utili, presi da varietà differenti.

Le applicazioni più lontane nel tempo – e ancora tutte da discutere – potrebbero essere quelle che riguardano la modifica dei geni umani nell’embrione, per eliminare eventuali difetti o favorire caratteristiche specifiche.
Fino a qualche mese fa una delle limitazioni che influivano sull’applicazone della metodologia in campo medico riguardava il fatto che il sistema CRISPR/Cas9 ed i suoi derivati, pur essendo molto più specifici nell’azione di modificazione genetica rispetto ai metodi alternativi, non fosse libero da errori: come la sua azione si applica sul bersaglio molecolare voluto, esiste infatti la possibilità che il complesso colpisca anche altre regioni del DNA producendo risultati inattesi.
È notizia però di questi giorni che un team italiano ha prodotto e brevettato un sistema praticamente infallibile il cui nome è evoCas9.

La ricerca è stata pubblicata su Nature Biotecnology.

Secondo la Professoressa Anna Cereseto, che ha scritto l’articolo che parla dello studio, “la molecola CRISPR-Cas9 sta cambiando la faccia della biomedicina. Il problema è che questa molecola fa errori sistematici e quando applicata al tentativo di curare malattie non modifica solo il gene o i geni implicati nella patologia, ma agisce su altri siti del DNA causando effetti imprevedibili. Ciò la rende inaccettabile per la pratica clinica. In questo momento la nostra evoCas9 è la macchina molecolare migliore al mondo per il genome editing”.
La torta è ghiotta quindi, e la sua storia non manca di contraddizioni e controversie: a contendersi onori e brevetti sono principalmente due parti. Le prime ricercatrici a capire che il macchinario batterico poteva essere usato per fare il cosiddetto editing genetico sono state l’americana Jennifer Doudna e la francese Emmanuelle Charpentier. La tecnica è stata però adattata alle cellule umane dal cinese naturalizzato americano Feng Zhang: e il primo brevetto vero e proprio è stato ottenuto proprio da Zhang.

di Stefano Bossi

 


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